Создана почти живая клетка с нуля. Она может показать, как на Земле зародилась жизнь

Разделение между неживой химией и живой биологией традиционно основывается на способности системы к воспроизводству, росту и эволюции по законам естественного отбора. До недавнего времени инженерия искусственной жизни развивалась преимущественно путем упрощения существующих микроорганизмов. Исследователи удаляли из живых бактерий неосновные гены, чтобы получить минимально жизнеспособный геном.

Однако существует альтернативный подход — создание искусственной клетки с нуля, используя исключительно неживые химические реагенты. Группа ученых из Миннесотского университета под руководством Катаржины Адамалы сделала важный шаг в этом направлении. Они сконструировали минимальную клетку, которая способна проходить через полный жизненный цикл, включающий копирование собственного генома, рост за счет поглощения питательных веществ, деление и конкуренцию за выживание. Все компоненты этой системы полностью известны, а их концентрации строго контролируются.

Конструкция искусственной клетки: оболочка и внутренняя среда

Искусственная клетка состоит из двух основных частей: защитной оболочки и внутренней биохимической среды, которая обеспечивает синтез белков.

В качестве оболочки авторы работы использовали липосомы — микроскопические пузырьки диаметром около 1,5 микрометра. Их мембрана состоит из смеси жировых молекул (липидов):

• диолеоилфосфатидилэтаноламина,
• диолеоилфосфатидилхолина,
• холестерина.

Эти вещества смешивают в строго определенном молекулярном соотношении 1:3:1. Полученный состав воспроизводит физические свойства естественных клеточных мембран, обеспечивая их стабильность и эластичность.

Внутреннее содержимое клетки представляет собой цитоплазму искусственного происхождения. Вместо использования грубых клеточных экстрактов, где точный состав белков и молекул неизвестен, ученые применили систему PURE (Protein Synthesis using Recombinant Elements). Это химически определенная смесь для синтеза белка вне живого организма. Она содержит более тридцати очищенных ферментов, рибосомы, выделенные из бактерий кишечной палочки, транспортные РНК, аминокислоты и молекулы-носители энергии (АТФ и ГТФ). Поскольку концентрация каждого компонента в системе PURE известна заранее, исследователи могут с высокой точностью предсказывать и контролировать направление биохимических реакций.

Геном искусственной клетки: почему важна децентрализация

Геном созданной минимальной клетки имеет общий объем около 90 тысяч пар нуклеотидов. В нем закодированы гены, необходимые для считывания информации с ДНК (транскрипции), синтеза белков (трансляции), копирования генома, а также для процессов питания и деления оболочки.

В отличие от природных клеток, у которых вся генетическая информация обычно объединена в одну крупную хромосому, геном искусственной клетки распределили по семи отдельным кольцевым молекулам ДНК — плазмидам. Это решение обусловлено физическими законами случайного распределения молекул при делении.

У искусственной клетки нет цитоскелета — сложной системы белковых нитей, которая в живой природе отвечает за точное и равное распределение хромосом между новыми клетками. Деление липосомы происходит случайным образом. Если бы геном состоял из одной ДНК-цепочки, существовал бы высокий риск того, что при делении мембраны вся генетическая информация осталась бы в одной половине, а вторая дочерняя клетка оказалась бы пустой и нежизнеспособной.

Разделение генома на семь небольших плазмид, присутствующих в клетке в нескольких копиях, решает эту проблему математически. При случайном делении пузырька вероятность того, что в каждую из новых клеток попадет хотя бы по одной копии каждой из семи плазмид, существенно возрастает. Анализ единичных клеток после пяти циклов деления подтвердил жизнеспособность этого подхода: около 30% дочерних клеток сохранили полный набор из семи плазмид и способность синтезировать белки.

Процесс питания: генетически контролируемый рост мембраны

Поскольку искусственная клетка не обладает сложным метаболизмом и не умеет самостоятельно синтезировать рибосомы или аминокислоты, она должна получать их извне. Для этого авторы разработали систему «кормовых» липосом. Это пузырьки меньшего размера (около 0,4 микрометра), которые содержат внутри белки системы PURE и запасы энергии, но лишены собственной ДНК.

Чтобы клетка могла поглощать эти ресурсы, процесс слияния мембран должен быть генетически закодирован в ее геноме. Механизм питания устроен следующим образом:

1. Синтез поры: на основе ДНК внутри клетки синтезируется мембранный белок альфа-гемолизин (αHL). В естественных условиях этот белок образует каналы в мембранах.
2. Химическая модификация: исследователи генетически модифицировали альфа-гемолизин, встроив в его структуру, выходящую на внешнюю сторону мембраны, последовательность из шести остатков аминокислоты гистидина (His-tag).
3. Подготовка корма: в мембрану «кормовых» липосом встроили специальные липиды, соединенные с молекулами нитрилотриуксусной кислоты, удерживающей ионы никеля (Ni-NTA).
4. Химическое связывание: когда искусственная клетка встречается с кормовой липосомой, остатки гистидина на ее поверхности вступают в прочную химическую координационную связь с ионами никеля на поверхности кормовой липосомы.

Это связывание сближает липидные мембраны настолько прочно, что они начинают сливаться друг с другом. В результате мембрана искусственной клетки увеличивается в площади (происходит рост оболочки), а внутреннее содержимое кормовой липосомы перетекает внутрь клетки, пополняя запасы энергии и строительных блоков для дальнейшего синтеза белков.

Физический механизм деления клеток

В отсутствие белкового цитоскелета процесс деления липосом был реализован за счет физического явления, известного как белковая теснота.

Когда на внешней поверхности липидной мембраны скапливается высокая концентрация крупных белковых молекул, им начинает не хватать места. Они начинают сталкиваться и оказывать механическое давление друг на друга. Мембрана липосомы стремится минимизировать это напряжение, из-за чего начинает изгибаться внутрь, уменьшая свой объем и стремясь разделиться на две части.

Чтобы запустить этот процесс, ученые использовали взаимодействие между белком стрептавидином и витамином биотином. В геном клетки встроили плазмиду, кодирующую альфа-гемолизин со специальной белковой меткой (FLAG-tag). После того как клетка вырастает за счет слияния с кормовыми липосомами, в среду добавляют связующий линкер, содержащий биотин, и белок стрептавидин.

Стрептавидин прочно связывается с биоценотическими метками на внешней стороне мембраны искусственной клетки. Плотное скопление молекул стрептавидина на поверхности мембраны создает избыточное давление, которое заставляет липидный бислой изгибаться. В результате липосома формирует перетяжку и распадается на более мелкие дочерние клетки меньшего диаметра.

Экспериментальное подтверждение деления клеток

Чтобы доказать, что деление действительно происходит, а не является результатом простого разрушения или склеивания липосом, ученые провели жесткий контролируемый эксперимент с использованием магнитных микрочастиц:

1. Иммобилизация на частицах: искусственные клетки первого поколения химически прикрепили к поверхности магнитных микрочастиц.
2. Запуск цикла: к прикрепленным клеткам добавили кормовые липосомы для роста, а затем стрептавидин для запуска процесса деления.
3. Разделение фракций: после завершения реакции пробирки поместили в магнитное поле. Клетки, которые остались прикрепленными к магнитным частицам («родительская» фракция), притянулись к стенке пробирки. Клетки, которые успешно разделились и отделились от родительских мембран («дочерняя» фракция), остались свободно плавать в растворе.
4. Анализ ДНК: биологи собрали обе фракции по отдельности и провели анализ на наличие ДНК методом количественной ПЦР.

Результаты показали, что ДНК искусственных клеток обнаруживалась в свободно плавающей фракции только в тех пробах, где присутствовали все компоненты деления (модифицированный белок мембраны, линкер и стрептавидин). В контрольных пробах, где отсутствовал хотя бы один элемент, ДНК в жидкой фракции не обнаруживалась. Это доказывает, что новые клетки образовались именно в результате генетически запрограммированного деления.

Конкуренция за ресурсы и эволюционный отбор

Для подтверждения способности искусственных клеток развиваться по законам естественного отбора исследователи провели эксперимент с двумя типами клеток.

В первой группе клеток ген альфа-гемолизина находился под контролем стандартного промотора T7 (участка ДНК, запускающего считывание гена). Во второй группе клеток использовали мутантный промотор повышенной силы T7Max. Клетки из группы T7Max синтезировали белки поры значительно быстрее.

Эксперимент по конкуренции проходил в несколько этапов:

• Равные стартовые условия: обе популяции клеток смешали в пробирке в соотношении 1:1.
• Ограничение ресурсов: в среду начали добавлять строго ограниченное количество кормовых липосом, создавая дефицит питания.
• Анализ поколений: после каждого цикла деления ученые измеряли соотношение клеток двух типов с помощью проточной цитометрии и секвенирования ДНК.

Поскольку клетки T7Max быстрее создавали поры на своей поверхности, они активнее поглощали кормовые липосомы и росли быстрее. В условиях дефицита ресурсов они забирали большую часть энергии, лишая питания клетки из группы T7.

За пять поколений доля клеток с эффективным промотором T7Max выросла с начальных 50% до 58%. В условиях экстремального дефицита ресурсов (когда количество кормовых липосом сократили в 10 раз) отбор происходил еще жестче: доля клеток T7Max достигла 70%, в то время как медленно растущие клетки T7 составили всего 29% популяции. Этот эксперимент наглядно продемонстрировал естественный отбор: случайное преимущество на уровне ДНК напрямую определило физическую выживаемость клеток в популяции.

Ограничения системы и вопросы биобезопасности

Созданная искусственная клетка представляет собой важную веху в синтетической биологии, однако она все еще значительно уступает по сложности даже простейшим природным микроорганизмам. Ее метаболизм ограничен, она не способна самостоятельно поддерживать энергетический баланс или синтезировать сложные белковые комплексы без внешней подпитки.

С точки зрения биобезопасности эта зависимость является важным преимуществом. Данная система обладает абсолютной формой зависимости от лабораторных условий. Клетка физически не способна размножаться или функционировать вне лаборатории, так как в естественной природе отсутствуют необходимые для ее деления и роста компоненты — очищенные ферменты PURE, стрептавидин и специфические липиды Ni-NTA. В случае случайного попадания за пределы пробирки искусственные клетки мгновенно прекращают свой цикл развития и разрушаются под действием внешней среды.

В будущем ученым предстоит решить задачи по интеграции в геном систем автономного синтеза рибосом и созданию управляемого искусственного цитоскелета. Это позволит сделать процессы роста и деления более эффективными и независимыми от внешних факторов.

Источник: bioRxiv