Мы никогда не были так близки к выращиванию мозга: новая технология наделила модели кровеносной системой

Исследователи разработали технологию создания васкуляризированных ассемблоидов — моделей мозга, пронизанных сложной сетью сосудов. Это позволило устранить зоны некроза внутри ткани, воссоздать гематоэнцефалический барьер и значительно ускорить созревание нейронов.

Одной из главных проблем современной нейробиологии остается создание достоверных моделей человеческого мозга. Мозговые органоиды — трехмерные структуры, выращенные из стволовых клеток — позволяют изучать развитие нервной ткани, но имеют важное ограничение: отсутствие кровеносной системы. В живом организме сосуды появляются на ранних этапах эмбриогенеза, обеспечивая доставку кислорода и сигнальных молекул. В лабораторных условиях органоиды получают питание только за счет пассивной диффузии из окружающей среды. В результате питательные вещества проникают лишь во внешние слои, а в центре формируется зона гипоксии и массовой гибели клеток (апоптоза).

Группа ученых из Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF) опубликовала результаты работы, в которой описан метод создания васкуляризированных кортикальных ассемблоидов (vCA). Новая технология позволяет интегрировать функциональную сосудистую сеть в ткань мозга in vitro, добиваясь высокой физиологической точности.

Физический предел роста и проблема «некротического ядра»

Классический кортикальный органоид представляет собой сферическое скопление клеток, выращенное из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. В процессе самоорганизации эти клетки формируют структуры, напоминающие кору головного мозга эмбриона. Однако по мере роста органоида его развитие останавливается.

Причина кроется в механизме доставки питательных веществ. В отсутствие кровеносных сосудов кислород и глюкоза проникают внутрь ткани исключительно путем пассивного впитывания. Эффективная глубина такого впитывания составляет не более 500 микронов (полмиллиметра). Как только диаметр органоида превышает этот предел, его центральная часть оказывается в условиях острого кислородного голодания (гипоксии).

Последствия этого процесса разрушительны для модели:

1. В центре органоида формируется зона некроза — мертвой ткани.
2. Клетки запускают процесс апоптоза (программируемой гибели).
3. Нарушается нормальная миграция нейронов и формирование связей между ними.

До сих пор попытки интегрировать сосуды в органоиды сводились к двум подходам: либо смешивание всех типов клеток на начальном этапе (что приводило к хаотичному росту), либо пересадка человеческого органоида в мозг мыши (ксенотрансплантация). Второй метод давал хорошие результаты, но делал модель непригодной для массовых испытаний из-за сложности, этических ограничений и присутствия животных белков.

Технология модульной сборки

Авторы нового исследования отказались от попыток вырастить нейроны и сосуды одновременно в одной среде. Вместо этого они применили принцип модульной сборки, основанный на раздельной дифференцировке тканей различного эмбрионального происхождения.

Процесс создания ассемблоида включает три основных этапа:

1. Формирование сосудистого модуля (VO): из стволовых клеток выращиваются отдельные органоиды, состоящие из клеток мезодермального происхождения — эндотелиальных клеток (выстилающих сосуды), перицитов (поддерживающих тонус сосудов) и фибробластов.
2. Формирование кортикального модуля (CO): параллельно выращиваются классические модели коры головного мозга, содержащие нейроны и глиальные клетки.
3. Контролируемое слияние: на 16-й день развития сосудистых модулей и 70-й день развития кортикальных модулей их объединяют в специальной матрице.

Результаты показали, что при таком подходе происходит активная миграция сосудистых клеток внутрь нервной ткани. В течение двух недель формируется густая, симметричная сеть капилляров, пронизывающая органоид насквозь. Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил отсутствие зон гипоксии в центре ассемблоида: сосудистая сеть успешно доставляла необходимые вещества во внутренние слои, предотвращая гибель клеток.

Воспроизведение гематоэнцефалического барьера

Самым значимым достижением работы стало доказательство функциональной зрелости выращенных сосудов. В организме сосуды мозга принципиально отличаются от сосудов в других органах. Они образуют гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) — структуру, которая строго контролирует поступление веществ из крови в мозг, защищая нейроны от токсинов и патогенов. Отсутствие ГЭБ в лабораторных моделях делало невозможным корректное тестирование лекарственных препаратов, так как многие вещества, работающие в пробирке, в реальности не могут проникнуть в мозг.

Анализ одиночных клеток (scRNA-seq) в ассемблоидах vCA выявил высокую экспрессию генов, отвечающих за формирование ГЭБ. Эндотелиальные клетки образовали так называемые плотные контакты, используя белки ZO-1 и клаудин-5. Это означает, что сосудистая сеть не просто присутствует физически, но и обладает избирательной проницаемостью.

Более того, исследователи зафиксировали явление артерио-венозной специализации. Даже в отсутствие сердца и активного кровотока эндотелиальные клетки разделились на артериальные, венозные и капиллярные подтипы. Это произошло под влиянием химических сигналов от окружающих нейронов и глиальных клеток, что подтверждает теорию о критической роли нервной ткани в обучении сосудистой системы.

Влияние васкуляризации на нейрогенез

Присутствие сосудистого компонента кардинально изменило развитие самой нервной ткани. Сосуды в данной системе выполняют функцию не только транспортной магистрали, но и сигнального центра, выделяющего факторы роста.

Сравнительный анализ васкуляризированных ассемблоидов и обычных органоидов показал следующие различия:

• Увеличение пула стволовых клеток: количество радиальной глии (клеток-предшественников нейронов) значительно возросло.
• Структурная организация: нейральные розетки (зоны активного деления клеток) стали более крупными и упорядоченными, сохраняя правильную геометрию дольше, чем в контрольных образцах.
• Созревание нейронов: наблюдалось ускоренное развитие синаптических связей и удлинение аксонов. Нейроны демонстрировали более сложные паттерны электрической активности. Вместо редких и хаотичных разрядов была зафиксирована регулярная ритмическая активность, свойственная развивающимся нейронным сетям.

Сравнение транскрипционного профиля клеток ассемблоида с атласом клеток реального мозга эмбриона показало высокую степень совпадения. Это подтверждает, что взаимодействие между сосудами и нейронами необходимо для запуска генетических программ, обеспечивающих правильное созревание коры головного мозга.

Значение для индустрии и медицины

Разработанная технология vCA имеет ряд преимуществ перед существующими методами. Во-первых, она полностью базируется на человеческих клетках, исключая видовые различия, неизбежные при работе с животными. Во-вторых, методика адаптирована для высокопроизводительного скрининга: использование стандартных 96-луночных планшетов позволяет выращивать сотни стандартизированных образцов одновременно.

Это открывает новые возможности для двух направлений:

1. Моделирование заболеваний: теперь возможно изучать патологии, связанные с нарушением взаимодействия сосудов и мозга, такие как болезнь Альцгеймера или последствия инсульта, в контролируемых лабораторных условиях.
2. Фармакология: наличие модели с функциональным гематоэнцефалическим барьером позволит на ранних этапах отсеивать препараты, не способные проникнуть в мозг, или, наоборот, разрабатывать новые методы доставки лекарств через этот барьер.

Главным ограничением текущей версии технологии остается отсутствие перфузии — активной циркуляции жидкости через сосуды под давлением. Сосудистая сеть сформирована и имеет просветы (люмены), но жидкость в них не движется. Авторы исследования указывают, что следующим шагом станет интеграция ассемблоидов с микрофлюидными чипами, которые обеспечат имитацию кровотока, что необходимо для окончательного физиологического созревания системы. Тем не менее, даже в статическом виде vCA представляет собой наиболее сложную и точную на сегодняшний день модель развивающейся коры головного мозга человека in vitro.

Источник: biorxiv