Впервые созданы настоящие гипоаллергенные собаки: как генетики избавили щенков от опасного для людей белка

Аллергическая реакция на домашних животных — одна из самых распространенных иммунных проблем в мире. По данным эпидемиологических исследований, от нее страдают около 15 процентов населения планеты. Чаще всего контакт с собаками вызывает у чувствительных людей аллергический ринит, конъюнктивит, кожные высыпания, а в тяжелых случаях — приступы бронхиальной астмы.

Долгое время считалось, что проблему можно решить подбором определенных пород или частой уборкой. Однако молекулярная биология показала, что эти методы не устраняют причину заболевания.

В научном журнале The CRISPR Journal группа исследователей из биотехнологической компании Kindred Companion Sciences и нью-йоркской клиники Comprehensive Allergy Clinic опубликовала результаты работы, которая меняет подход к этой проблеме. Ученые не стали пытаться изменить иммунную систему человека, а устранили источник аллергена в организме самого животного. С помощью генетического редактирования и клонирования они вывели двух здоровых биглей, организм которых полностью лишен главного собачьего аллергена — белка Can f 1.

Почему не работают «гипоаллергенные» породы и обычная медицина

Главное заблуждение об аллергии на животных связано с шерстью. Сама по себе шерсть нейтральна и не вызывает иммунного ответа. Реакцию провоцируют специфические белки, которые вырабатываются в слюнных железах, а также в сальных железах кожи собаки. Когда животное вылизывает себя, слюна покрывает волосяной покров. Затем жидкость испаряется, а микроскопические частицы сухого белка вместе с отшелушивающимися чешуйками кожи отделяются от тела и поднимаются в воздух. Эти частицы настолько малы, что часами удерживаются в жилых помещениях и легко проникают в дыхательные пути человека.

Породы, которые заводчики называют гипоаллергенными — пудели, йоркширские терьеры, бишоны или дизайнерские гибриды вроде голдендудлей, имеют шерсть особой структуры, которая меньше выпадает. Но они выделяют точно такое же количество белка в слюне и кожном сале. Лабораторные замеры содержания аллергенов в домах показывают, что концентрация опасных белков в воздухе не зависит от породы собаки.

Традиционные медицинские методы решения проблемы также имеют ограничения:

1. Антигистаминные препараты и назальные спреи. Они только временно блокируют симптомы воспаления, не влияя на саму причину гиперчувствительности.
2. Аллерген-специфическая иммунотерапия. Метод заключается в регулярном введении пациенту микродоз аллергена на протяжении нескольких лет, чтобы приучить иммунную систему не реагировать на раздражитель. В случае с пыльцой растений или пылевыми клещами этот метод показывает высокую эффективность, но при аллергии на собак результаты терапии остаются нестабильными и часто не дают стойкого эффекта.
3. Бытовые меры. Использование воздушных фильтров высокой очистки и постоянное мытье животного лишь незначительно снижают концентрацию белка в помещении, чего недостаточно для людей с высокой чувствительностью.

Единственный способ полностью исключить контакт с аллергеном — прекратить его производство в организме животного.

Главный виновник: структура и свойства белка Can f 1

У собак обнаружено шесть основных белков, способных вызывать аллергию у людей. Им присвоены международные обозначения от Can f 1 до Can f 6. Однако иммунный ответ распределен между ними крайне неравномерно.

Основную массу всех аллергических реакций вызывает белок Can f 1. Более половины людей с аллергией на собак имеют антитела именно к этому веществу. По своей структуре Can f 1 относится к семейству липокалинов. Это небольшие белки, которые в норме выполняют транспортные функции: связывают и переносят жирорастворимые молекулы, витамины, стероиды и феромоны.

Когда Can f 1 попадает на слизистую оболочку дыхательных путей предрасположенного человека, иммунная система ошибочно распознает его как опасный патоген. В ответ организм начинает вырабатывать специфические иммуноглобулины класса E (IgE). Эти антитела прикрепляются к тучным клеткам и базофилам. При повторном попадании даже микроскопической дозы Can f 1 тучные клетки мгновенно разрушаются, выбрасывая в кровь и ткани гистамин — вещество, вызывающее отек, спазм бронхов, зуд и воспаление.

Перед генетиками стоял вопрос: можно ли удалить ген Can f 1 без вреда для самой собаки? Точная биологическая роль этого белка в организме псовых оставалась неизвестной. Существовала вероятность, что отключение гена нарушит эмбриональное развитие щенка или приведет к хроническим болезням после рождения.

Технология редактирования: как выключили нужный ген

Прямое редактирование оплодотворенных собачьих яйцеклеток — технически сложная и ненадежная задача. Из-за особенностей полового цикла у собак манипуляции с эмбрионами на ранних стадиях часто приводят к мозаицизму. Так называют состояние, при котором часть клеток развивающегося эмбриона успевает изменить свой генетический код, а часть остается неизмененной. В таком случае собака все равно продолжит вырабатывать аллергенный белок.

Чтобы получить полностью отредактированное животное, авторы применили двухэтапную стратегию: модификацию клеток в пробирке с последующим клонированием.

Этап 1. Модификация культуры клеток

Ученые взяли первичные клетки соединительной ткани (фибробласты) плода собаки породы бигль. В эти клетки с помощью электрического импульса (методом электропорации) ввели систему CRISPR-Cas9. Она состояла из двух компонентов: белка-нуклеазы Cas9, выполняющего роль молекулярного резака, и синтетической направляющей РНК (gRNA), которая указывает ферменту точное место в геноме.

Целевой мишенью выбрали первый экзон — начальный информационный блок гена Can f 1. Фермент Cas9 сделал двухцепочечный разрыв в строго заданном месте ДНК. Клеточные системы восстановления попытались устранить поломку, но допустили ошибку: в точку встроился один лишний нуклеотид (вставка 1 пары нуклеотидов).

Эта единичная вставка привела к сдвигу рамки считывания. Генетическая информация считывается рибосомами тройками нуклеотидов (кодонами). Добавление одной буквы сместило все последующие тройки. В результате генетический код превратился в бессмысленный набор инструкций, содержащий преждевременный стоп-сигнал. Клетка полностью потеряла способность синтезировать белок Can f 1.

Этап 2. Соматическое клонирование (SCNT)

Исследователи вырастили изолированные колонии отредактированных клеток, выделили из них ДНК и провели проверку. Они отобрали клетки, в которых мутация произошла точно в целевом гене.

Затем применили технологию переноса ядер соматических клеток (Somatice Cell Nuclear Transfer, SCNT). Из зрелых донорских яйцеклеток собак под микроскопом удалили собственное ядро, содержащее материнскую ДНК. На его место с помощью микропипетки перенесли ядро из подготовленного отредактированного фибробласта.

Таким способом биологи получили 25 эмбрионов, несущих заданную генетическую модификацию. Все эмбрионы пересадили суррогатной самке бигля. Два эмбриона успешно прикрепились к стенке матки и развились в доношенных щенков.

22 сентября 2024 года родились две самки бигля весом 320 и 318 граммов. Их назвали Элфи и Бейли.

Анализ безопасности: проверка ДНК и физического состояния

Любое использование технологии CRISPR связано с риском нецелевых мутаций. Если направляющая РНК свяжется с похожим участком ДНК в другом месте генома, фермент Cas9 может повредить жизненно важный ген.

Авторы исследования провели полную проверку ДНК родившихся щенков двумя независимыми методами:

1. Таргетный анализ вероятных мест ошибок. Специальная программа CHOPCHOP проанализировала весь геном собаки и нашла 11 участков, наиболее похожих на целевую последовательность гена Can f 1. Ученые размножили эти участки с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и прочитали их структуру по методу Сэнгера. Все 11 потенциально уязвимых участков остались нетронутыми.
2. Полногеномное секвенирование (WGS). ДНК щенков расшифровали целиком с высокой точностью — глубина прочтения превысила 49 крат. Исследователи проверили 413 теоретически возможных точек связывания нуклеазы в геноме. Сравнение с исходными клетками подтвердило: в ДНК щенков не появилось ни одной случайной мутации, а также не возникло крупных хромосомных повреждений или перестроек.

Ветеринарный мониторинг показал, что отсутствие белка Can f 1 никак не повлияло на организм собак. За развитием щенков следили с момента рождения. Масса их тела росла строго по стандартам породы и во взрослом возрасте составила нормальные для самок бигля 9-10 килограммов.

Рентгеновские снимки грудной клетки и брюшной полости подтвердили правильное формирование костей скелета, нормальные размеры сердца, легких и внутренних органов. Животные демонстрировали стандартное игровое поведение, хороший аппетит и адекватный уровень активности. Обязательный курс вакцинации прошел без аллергических осложнений или иммунных сбоев.

Экспериментальное подтверждение: отсутствие аллергена и реакция человека

Чтобы доказать, что модификация действительно уничтожила аллерген, исследователи провели серию биохимических и клинических тестов.

В эксперименте сравнивали образцы четырех собак:

• отредактированного бигля с выключенным геном (ΔCanF1);
• контрольного бигля с обычным геномом (дикий тип);
• стандартного пуделя;
• голдендудля.

Белковый анализ слюны и перхоти

У животных взяли образцы слюны с помощью специальных синтетических тампонов, а также вычесали образцы подшерстка и перхоти. Белковый состав проб разделили в полиакриламидном геле (метод SDS-PAGE), после чего провели иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг) с использованием кроличьих антител, настроенных исключительно на распознавание белка Can f 1.

Анализ показал яркую полосу белка Can f 1 массой 23 килодальтона в пробах обычного бигля, пуделя и голдендудля. В пробах отредактированного бигля прибор не зафиксировал ни малейших следов этого белка ни в слюне, ни в чешуйках кожи. Это подтвердило, что генетическая вставка полностью остановила производство белка во всех тканях.

Кожное тестирование на человеке

Финальной проверкой стал стандартный кожный прик-тест. Его провели на взрослом добровольце с подтвержденной аллергией на собак. Молекулярная диагностика крови пациента заранее подтвердила, что его иммунная система реагирует исключительно на Can f 1 (уровень антител sIgE составил 0,78 kU/L), а к другим собачьим аллергенам (Can f 2-6) чувствительности нет.

На внутреннюю поверхность предплечья с помощью специального аппликатора одновременно нанесли тестовые растворы. Через 20 минут измерили диаметр образовавшихся папул (волдырей):

• Отрицательный контроль (физраствор): 0 мм (реакция отсутствует).
• Положительный контроль (гистамин): яркая папула, подтверждающая реактивность кожи.
• Стандартный коммерческий экстракт собачьего аллергена: папула диаметром около 7 мм.
• Слюна обычного бигля: папула диаметром около 6 мм.
• Слюна пуделя: папула диаметром 5,3 мм.
• Слюна голдендудля: папула диаметром 7,7 мм.
• Слюна отредактированного бигля (ΔCanF1): 0 мм (полное отсутствие папулы и покраснения).

Аналогичный тест с экстрактами перхоти и шерсти дал точно такие же результаты: обычные собаки, включая пуделя и дудля, вызвали сильное местное аллергическое воспаление, тогда как экстракт модифицированного животного не вызвал никакой реакции, оказавшись неотличимым от физраствора.

Перспективы технологии и ее ограничения

Успешное выведение биглей без белка Can f 1 доказывает осуществимость идеи полного устранения аллергенов у животных.

Генетический анализ показал, что первый экзон гена Can f 1 имеет абсолютно одинаковую структуру у самых разных пород собак. Участок ДНК, на который ориентируется направляющая РНК, полностью совпадает у овчарок, ретриверов, терьеров и догов. Это означает, что ту же самую генетическую конструкцию можно применять для редактирования представителей любых других пород без необходимости перенастраивать систему.

Однако перед внедрением технологии в широкую практику остаются нерешенные задачи:

1. Множественная сенсибилизация. Хотя Can f 1 отвечает за большинство случаев аллергии, у некоторых пациентов реакцию вызывают другие компоненты: Can f 2 (еще один липокалин), Can f 3 (сывороточный альбумин) или Can f 5 (простатический калликреин, который выделяется только кобелями). Людям с поливалентной аллергией контакт с биглями ΔCanF1 не поможет. Чтобы решить эту проблему, в будущем потребуется методмультиплексного редактирования— одновременное отключение двух или трех генов-аллергенов в одной клетке.
2. Размер выборки. Опубликованная работа представляет собой первичное доказательство работоспособности концепции (proof-of-concept). Исследование провели на двух собаках и одном человеке-добровольце. Для коммерческого и медицинского применения потребуются испытания на широкой группе людей с различными формами аллергии, а также наблюдение за здоровьем нескольких поколений отредактированных животных.
3. Этика и доступность. Использование клонирования и генетического редактирования домашних животных требует четкого законодательного регулирования. Необходимо гарантировать, что модификации не снижают качество жизни самих животных и не приводят к скрытым патологиям при их дальнейшем разведении.

Тем не менее эксперимент наглядно показал, что современная молекулярная биология способна решать проблемы гиперчувствительности человека на генетическом уровне. Устранение одного некодирующего фрагмента ДНК позволило избавить животное от выработки аллергенного белка, не повлияв на его анатомию, поведение и здоровье. Это открывает возможность для создания линий служебных собак-поводырей и домашних питомцев, контакт с которыми безопасен для людей с аллергическими заболеваниями.

Источник: The CRISPR Journal