Мутанты с заброшенной промзоны: как микробы старого завода научились поглощать отходы металлургии

В американском штате Пенсильвания, на территории так называемого Ржавого пояса, продолжается масштабное переустройство старых промышленных зон. Город Питтсбург, который в двадцатом веке был главным центром металлургии США, сегодня активно застраивает заброшенные заводские территории. На месте старых цехов появляются жилые районы, технологические парки и университетские лаборатории.

Один из самых крупных проектов такого рода — территория Хейзелвуд-Грин. Это участок площадью 72 гектара на берегу реки Мононгахила. Больше ста лет здесь работали предприятия металлургической компании Jones & Laughlin Steel. В период наивысшей активности завода на нем трудились тысячи человек, а производство давало миллионы тонн стали для строительства мостов, железных дорог и различной техники.

Однако непрерывное производство на протяжении века оставило после себя серьезные последствия. Вся территория оказалась загрязнена отходами переработки угля, нефти и выплавки чугуна. Участок перевели в категорию так называемых браунфилдов — земель, дальнейшее использование которых невозможно без предварительной очистки от токсичных веществ.

Пока инженеры и градостроители очищают верхние слои грунта для строительства новых зданий, биологи из расположенного рядом Университета Карнеги — Меллона занялись изучением глубинных слоев почвы. Они выяснили, что в отравленной земле все это время продолжалась скрытая биологическая активность. Местные бактерии за многие десятилетия смогли приспособиться к тяжелым ядам и научились использовать их для поддержания собственной жизни.

Токсичное наследство коксовых печей

Чтобы понять, с чем именно столкнулись микроорганизмы в почве под заводом, нужно разобрать состав металлургических отходов. При производстве стали требуется кокс — продукт переработки каменного угля при высоких температурах без доступа воздуха. В процессе коксования угля и перегонки сопутствующих смол выделяется огромное количество химических соединений.

Наиболее опасную часть этих отходов составляет группа летучих органических веществ, которые в экологии называют аббревиатурой БТЭК. В эту группу входят четыре химических соединения:

• Бензол
• Толуол
• Этилбензол
• Ксилол (и его изомеры)

Все эти вещества относятся к ароматическим углеводородам. В основе их химической структуры лежит так называемое бензольное кольцо — кольцо из шести атомов углерода, соединенных между собой особыми связями. Из-за равномерного распределения электронной плотности разорвать такое кольцо обычным химическим путем очень сложно. Эти соединения годами сохраняются в почве и грунтовых водах, не разлагаясь под действием солнечного света, воздуха или влаги.

Для человека и большинства животных вещества группы БТЭК представляют непосредственную опасность. Они относятся к первому и второму классам токсичности. Бензол разрушает кроветворную систему и вызывает лейкемию, а толуол и ксилол поражают центральную нервную систему, почки и печень. При попадании в обычную почву эти углеводороды растворяют липиды, из которых состоят внешние оболочки живых клеток. Для большинства природных микроорганизмов проникновение таких веществ в грунт означает быструю гибель.

Механизм приспособления бактерий к ядам

В одном грамме чистой садовой или лесной почвы обычно живет от одного до десяти миллиардов микроорганизмов, которые принадлежат к тысячам различных видов. Они выполняют важную экологическую задачу: перерабатывают опавшую листву, отмершую траву и древесину, превращая сложные органические соединения в доступные для растений питательные элементы — углекислый газ, азот, фосфор и воду. Основой их питания служат сахара, белки и другие простые углеводы.

Когда на заводе в Хейзелвуд-Грин в почву начали попадать промышленные растворители, масла и коксохимические отходы, экологическое равновесие нарушилось. Большинство обычных почвенных бактерий погибло из-за токсического повреждения оболочек и остановки клеточного дыхания. В грунте остались только редкие клетки, которые случайно обладали генетическими мутациями, позволившими им пережить контакт с химикатами.

Однако устойчивость к яду была только первым шагом. Чтобы бактерия могла активно размножаться, ей нужен углерод. Углерод — это основной строительный материал для любых органических молекул: из него строятся клеточные стенки, белки, ферменты и молекулы ДНК. В нормальных условиях бактерии берут углерод из растительных остатков или органических кислот. Но на глубине металлургического завода под слоем строительного мусора и шлака никаких растительных остатков не было. Единственным доступным источником органического углерода там были сами загрязнители — бензол, толуол и их производные.

У выживших бактерий сработал механизм естественного отбора. Среди миллионов погибших микроорганизмов единичные штаммы обладали редкими белками-ферментами — оксигеназами. Эти ферменты способны присоединять молекулы кислорода к устойчивому бензольному кольцу, ослаблять связи между атомами углерода и расщеплять кольцо на простые цепочки. Затем полученные обломки молекулы клетка направляет в свой обычный цикл обмена веществ, получая из токсина энергию и материал для строительства собственного тела.

Для микробов этот процесс не имеет этической окраски: они не «очищают планету», они просто едят единственное вещество, которое доступно в окружающей среде. Погибшие виды перестали потреблять воду и минеральные соли, освободив экологическую нишу. Те бактерии, которые смогли расщеплять токсины, получили преимущество и стали размножаться в огромных количествах.

В бактериальном мире передача полезных свойств происходит намного быстрее, чем у высших организмов. Бактериям не обязательно дожидаться появления сотен новых поколений, чтобы передать признак потомству. Они способны передавать части своего генетического кода напрямую соседним клеткам других видов. Для этого бактерии используют небольшие кольцевые молекулы ДНК — плазмиды. В плазмидах как раз и записываются инструкции для производства ферментов, разрушающих токсины. В результате этого процесса ген устойчивости и переработки яда за десятилетия распространился по всему подземному сообществу Хейзелвуд-Грин.

Как ученые исследуют подземные сообщества

Команда микробиологов с кафедры биологических наук Университета Карнеги — Меллона решила досконально изучить структуру и возможности этого микробного сообщества. Их исследовательская лаборатория находится всего в трех километрах от Хейзелвуд-Грин.

Чтобы добраться до бактерий, исследователи используют метод бурения кернов. Специальная установка вбивает в землю полую металлическую трубу и извлекает из нее цилиндрический столб грунта длиной в несколько метров. Этот цилиндр сохраняет порядок залегания пластов земли именно в том виде, в котором они формировались десятилетиями.

Верхние пласты содержат чистый насыпной грунт, который привезли строители для выравнивания площадки. Глубже начинаются слои, которые накапливались во второй половине двадцатого века, а на самом дне керна находится земля начала двадцатого века, когда завод только начинал работать.

После извлечения керна ученые сталкиваются с технической проблемой. Классическая микробиология требует вырастить бактерию в пробирке или на чашке со специальным питательным желе (агар-агаром). Однако известно, что в лабораторных условиях удается вырастить не более одного процента от всех существующих в дикой природе микроорганизмов. Остальные девяносто девять процентов бактерий отказываются расти в стандартных питательных средах и погибают, поэтому изучить их классическими методами невозможно.

Чтобы преодолеть это ограничение, исследователи применили метагеномное секвенирование:

1. Образец загрязненной почвы берут с определенной глубины керна.
2. С помощью химических реагентов разрушают все находящиеся в образце бактериальные клетки.
3. Из полученной смеси выделяют всю содержащуюся в ней ДНК.
4. Высокопроизводительные секвенаторы считывают последовательности генетического кода всех микроорганизмов сразу, создавая единый цифровой массив данных.

После этого специальное программное обеспечение разделяет гигантский массив генетического кода на отдельные фрагменты и определяет, какие именно виды бактерий живут в грунте и какие гены присутствуют в их ДНК. Главной задачей биоинформатиков был поиск генов, отвечающих за производство оксигеназ — тех самых ферментов, которые расщепляют бензольные кольца соединений БТЭК.

Сопоставив данные архивных карт завода с полученными генетическими последовательностями, ученые увидели прямую закономерность: чем выше была концентрация химикатов в определенном месте пятьдесят или семьдесят лет назад, тем больше специализированных генов деградации токсинов содержится в ДНК современных почвенных микробов на этой глубине.

Лабораторный эксперимент: доказательство переработки

Наличие гена в ДНК указывает лишь на потенциальную способность бактерии производить нужный фермент. Чтобы доказать, что бактерии из Хейзелвуд-Грин действительно уничтожают ядовитые вещества, исследователям потребовалось провести прямой биологический эксперимент.

Для этого микробиологи выделили живые культуры бактерий из отобранных образцов грунта и применили методику так называемой минимальной питательной среды:

1. Подготовка чистой среды. В лабораторные колбы наливают дистиллированную воду и добавляют в нее строго отмеренное количество минеральных солей — источников азота, фосфора, калия и магния. Эти элементы необходимы для поддержания базовой жизнедеятельности клетки.
2. Исключение обычных питательных веществ. В среду категорически запрещено добавлять глюкозу, сахарозу, дрожжевой экстракт, аминокислоты или любые другие стандартные органические соединения. В такой воде нет ни единого атома углерода. Обычная бактерия в этих условиях не может делиться и быстро гибнет от истощения ресурсов.
3. Внесение загрязнителя. В герметично закрытую колбу добавляют единственный источник углерода — токсичное вещество высокой степени очистки: чистый бензол, толуол, этилбензол или ксилол.
4. Наблюдение за ростом биомассы. Колбы помещают в инкубатор при постоянной температуре и перемешивании. Если раствор внутри колбы начинает мутнеть, это однозначно указывает на рост числа бактериальных клеток.

Помутнение раствора подтверждает строгий научный факт: микроорганизм выжил исключительно за счет поглощения добавленного токсина. Бактерия захватывает молекулу бензола или толуола, расщепляет ее ферментами внутри своей клетки и включает освобожденный углерод в состав собственных белков и клеточных стенок. В процессе этого дыхания опасный промышленный канцероген превращается в безвредный углекислый газ, обычную воду и растущую массу бактерий.

Роботизация и программный поиск новых штаммов

Выделение и ручная проверка каждого микроорганизма пипетками занимают недели работы лаборантов. Количество видов в почве огромно, а ручной труд сильно ограничивает масштаб исследований. Чтобы ускорить работу, исследователи объединили усилия со специализированной роботизированной лабораторией AI Science Foundry. Примечательно, что эта лаборатория расположена на территории комплекса Бейкери-Сквер — еще одного бывшего питтсбургского промышленного участка, который прошел очистку несколько лет назад.

В этой лаборатории рутинные операции выполняют автоматические роботизированные манипуляторы:

• Роботы вносят бактериальные культуры в пластиковые микропланшеты, разделенные на сотни крошечных ячеек.
• В каждую ячейку автоматически дозируется определенная концентрация загрязнителя и минеральной среды.
• Оптические сканеры каждый час измеряют прозрачность каждой лунки, фиксируя точную скорость роста бактериальной популяции.
• Газовые хроматографы измеряют концентрацию токсина в воздухе над лункой, подтверждая, что вещество именно расщепляется микробами, а не просто испаряется наружу.

Параллельно ученые создали открытую компьютерную программу BTEXgenie. Этот программный алгоритм работает как специализированная поисковая система для ДНК. Программа просматривает расшифрованные геномы бактерий и ищет в них специфические участки кода, которые кодируют ферменты для расщепления бензола и толуола.

Благодаря этой программе исследователи больше не проверяют все бактерии подряд. Сначала компьютер анализирует прочитанные последовательности ДНК и указывает на конкретные бактерии, у которых с высокой вероятностью есть необходимые механизмы переработки химикатов. Затем роботизированный комплекс проверяет только эти выбранные штаммы в реальном лабораторном эксперименте. Если бактерия подтверждает свои свойства, данные об этом возвращаются в программу, улучшая точность ее следующих прогнозов.

Почему это открытие меняет технологии очистки почв

Проблема загрязнения промышленных территорий актуальна для сотен городов по всему миру. До сегодняшнего дня инженерная практика решала эту проблему двумя основными методами, у каждого из которых есть принципиальные недостатки.

Первый метод — механическая выемка грунта. Экскаваторы выкапывают тысячи кубических метров отравленной земли, грузят ее на самосвалы и увозят на специализированные полигоны опасных отходов для захоронения. Этот метод требует огромных финансовых затрат на транспортировку и работу тяжелой техники. Главный его недостаток заключается в том, что сам химикат не уничтожается: загрязнение просто перемещают из одного района в другой, где его продолжают хранить в земле.

Второй метод — изоляция или консервация участка. Отравленную почву не вывозят, а запечатывают сверху толстым слоем глины, геотекстильными мембранами, щебнем или слоем бетона. Сверху насыпают слой плодородной почвы и высаживают траву. Этот подход дешевле выемки, но он оставляет опасные вещества в грунте навсегда. Со временем защитные мембраны разрушаются, и токсичные соединения начинают просачиваться в глубинные водоносные горизонты, попадая в колодцы и реки.

Биологическая очистка — биоремедиация — предлагает совершенно иной подход. Она предполагает разрушение молекул токсинов непосредственно в грунте без перемещения земляных масс. Однако классическая биоремедиация часто сталкивалась с трудностями при переходе из лаборатории на реальный объект:

• Ученые брали стандартные лабораторные штаммы бактерий, которые хорошо разлагали бензол в стерильных колбах, и вносили их в загрязненную почву на улице.
• В девяноста процентах случаев эти бактерии быстро погибали.
• Причиной гибели становились реальные условия внешней среды: слишком высокая кислотность или щелочность грунта, присутствие солей тяжелых металлов (свинца, кадмия, цинка), перепады температур от зимних морозов к летней жаре, а также давление со стороны местных бактерий.

Штаммы, обнаруженные на территории Хейзелвуд-Грин, принципиально отличаются от выращенных в лаборатории микроорганизмов. Они сформировались в результате реального отбора в сложной и агрессивной среде. Эти бактерии на протяжении десятилетий жили в присутствии не одного чистого химиката, а смеси из десятков токсичных веществ, тяжелых металлов и машинных масел. Они приспособлены к сезонным колебаниям климата Пенсильвании и умеют успешно конкурировать с другими микроорганизмами за воду и жизненное пространство.

Практическое применение результатов

Исследование бактерий из Питтсбурга открывает путь к созданию технологий естественной очистки сложных промышленных зон. Зная, какие именно виды бактерий способны расщеплять опасные углеводороды и какие гены обеспечивают этот процесс, экологи могут применять методы направленной стимуляции местных почвенных микроорганизмов.

Вместо завоза искусственно созданных штаммов специалисты могут стимулировать рост уже имеющихся в почве устойчивых бактерий. Для этого в загрязненные слои грунта через специальные скважины подают определенные минеральные соли, воду и кислород, необходимые микробам для дыхания. Получив нужные элементы, автохтонные микроорганизмы начинают стремительно размножаться и перерабатывать накопленные в почве запасы бензола, толуола и ксилола прямо на месте, не требуя раскопки территории.

Изучение микробных популяций Хейзелвуд-Грин показывает, что загрязненные промышленные территории представляют собой не просто мертвые зоны техногенного ущерба, а источники специализированных биологических адаптаций. В ответ на разрушительное химическое воздействие со стороны человека природные сообщества бактерий выработали эффективные молекулярные механизмы нейтрализации этих веществ. Расшифровка этих механизмов с помощью метагеномного секвенирования и роботизированного анализа позволяет превратить накопленные за столетие отходы металлургии в инструмент для экологического восстановления территорий.

Источник: biorxiv