Клетки человеческого мозга прожили пять лет в пробирке: они зафиксировали ход времени и научились перематывать этапы развития

Мозг человека развивается значительно дольше, чем мозг любого другого млекопитающего. Если лабораторной мыши требуются считанные недели, чтобы сформировать готовую нервную систему, то человеку для полного созревания коры больших полушарий нужно около двадцати лет. В биологии этот феномен называют неотенией — задержкой в развитии и сохранением ювенильных черт.

Долгое время исследователи спорили о том, что именно управляет этой медлительностью. Одна гипотеза утверждала, что развитием управляет весь организм: эндокринная система, приток питательных веществ с кровью, иммунные сигналы и постоянный поток информации от органов чувств. Другая гипотеза предполагала, что скорость созревания запрограммирована внутри самих нервных клеток.

Группа ученых из Гарвардского университета и Института Броуда под руководством профессора Паолы Арлотты (Paola Arlotta) получила прямое доказательство второй гипотезы. В работе, опубликованной в журнале Nature, авторы описали методику выращивания кортикальных органоидов человека на протяжении рекордного срока — более пяти лет.

Органоиды — это выращенные из стволовых клеток трехмерные скопления живых тканей, которые воспроизводят клеточный состав и структуру реальных органов. Исследование показало, что даже в полной изоляции от человеческого тела клетки мозга последовательно проходят этапы развития, строго соответствующие многолетнему графику взросления человека, фиксируют прожитое время на уровне ДНК и сохраняют необратимую память о пройденных стадиях.

Почему выращенные в лаборатории нейроны погибали раньше

Кортикальные органоиды получают из плюрипотентных стволовых клеток, которые способны превращаться в любые типы клеток организма. Под действием химических сигналов эти клетки начинают формировать зачатки слоев коры головного мозга. Однако в течение многих лет у этой технологии оставался критический барьер: органоиды удавалось поддерживать в жизнеспособном состоянии лишь несколько месяцев.

В стандартных питательных растворах возбуждающие нейроны — главные клетки коры, отвечающие за передачу сигналов, постепенно погибали. В тканях оставались преимущественно вспомогательные клетки: астроциты и клетки-предшественники. Из-за этого органоиды отражали только самые ранние этапы развития эмбриона (первый и начало второго триместра беременности) и не позволяли изучать созревание мозга в поздний пренатальный и постнатальный периоды.

Авторы новой работы установили биологическую причину гибели нейронов: нервным клеткам для выживания необходима постоянная электрическая активность. Если нейроны не обмениваются электрохимическими импульсами, в них запускается запрограммированная клеточная гибель (апоптоз). Стандартные питательные среды поддерживали базовый метаболизм, но подавляли спонтанную передачу импульсов.

Чтобы устранить этот дефект, исследователи создали новую питательную среду под названием APM (Activity-Permissive Medium — среда, допускающая активность). В ее основу лег раствор BrainPhys, разработанный для поддержания физиологических свойств нейронов. Его дополнили комплексом активных веществ:

• белками-нейротрофинами BDNF и GDNF, стимулирующими рост и выживание нейронов;
• компонентами внеклеточного матрикса (ламинином), обеспечивающими механическую поддержку клеток;
• стабильной формой глутамина (GlutaMax), предотвращающей накопление токсичного для нейронов аммиака.

Органоиды переводили на среду APM на 70-й день после начала культивирования. Результаты этого изменения проанализировали несколькими независимыми методами:

1. Электронная микроскопия синапсов. Через один год в органоидах из среды APM плотность синапсов (мест контакта между нейронами) оказалась значительно выше, чем в стандартной среде. Кроме того, 52% синапсов сформировались на дендритных шипиках — специализированных выростах, необходимых для устойчивой передачи сигналов в зрелой коре. В контрольной группе на шипиках располагалось лишь 25% синапсов.
2. Экспансионная микроскопия нейронов. Исследователи физически увеличили фрагменты ткани с помощью полимерного гидрогеля и проанализировали трехмерную форму отдельных нейронов. Клетки в среде APM сформировали длинные и сложные отростки с высоким уровнем ветвления, что характерно для зрелых нейронов коры (p = 0,0034 по шкале Стралера).
3. Регистрация электрических сигналов. С помощью кремниевых чипов с микроэлектродами (3D-MEA) ученые непрерывно измеряли спонтанные потенциалы действия. В стандартной среде через год органоиды полностью прекратили синхронную активность. В среде APM органоиды продолжали генерировать согласованные пачки импульсов даже через два года культивирования. В них сформировались отдельные группы клеток, которые активировались независимо друг от друга, демонстрируя функциональное разделение нейронных цепей.

Молекулярный учет времени: генетический анализ 420 тысяч клеток

Чтобы проверить, насколько точно органоиды повторяют развитие настоящего мозга, ученые применили секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq). Этот метод позволяет оценить активность всех работающих генов в каждой отдельной клетке. Всего авторы проанализировали 424 720 клеток на 16 временных этапах — от 15 дней до 5 лет культивирования.

Полученные данные сопоставили с транскриптомными атласами реального человеческого мозга, охватывающими период от эмбрионального развития до возраста 23 лет. Сопоставление показало непрерывное и последовательное созревание:

• Органоиды возрастом от 15 дней до 2 месяцев активировали гены, характерные для первого триместра беременности (активное деление клеток-предшественников и закладка ранних структур).
• В возрасте от 3 до 6 месяцев органоиды перешли к программам второго триместра (формирование основных популяций нейронов и появление первых синапсов).
• Начиная с 9-12 месяцев и до 5 лет клетки последовательно включали генные модули, которые в норме активны у новорожденных детей и детей первых лет жизни.

Параллельно шло развитие глиальных клеток. К шести месяцам культивирования в органоидах появились зрелые олигодендроциты — клетки, создающие миелиновую оболочку вокруг нервных волокон. С помощью электронной микроскопии исследователи подтвердили, что эти клетки начали физически оборачивать аксоны миелином, ускоряющим прохождение нервного импульса. 80,2% генов в астроцитах органоидов изменяли свою активность во времени точно так же, как в реальном мозге человека.

Эпигенетические метки как способ измерения возраста ткани

Следующим шагом стала проверка эпигенетического состояния клеток. Эпигенетика изучает изменения в работе генов, которые не затрагивают саму последовательность ДНК. Главный из таких механизмов — метилирование ДНК, при котором к цитозинам (буквам «С» в генетическом коде) присоединяются химические метильные группы (-CH3).

По мере взросления организма рисунок распределения метильных меток закономерно меняется. На основе этих изменений ученые создают математические алгоритмы — эпигенетические часы, позволяющие точно определить биологический возраст ткани по анализу ДНК.

Авторы применили к органоидам полногеномное бисульфитное секвенирование (WGBS) на девяти временных точках от 3 месяцев до 5 лет, после чего рассчитали их возраст по двум известным алгоритмам: мультитканевым часам Хорвата и специализированным часам для коры головного мозга.

Результаты показали прямую линейную зависимость между реальным временем нахождения органоида в инкубаторе и расчетным эпигенетическим возрастом (r = 0,88-0,90). ДНК в органоидах накапливала химические метки с той же скоростью, с какой это происходит в развивающемся мозге ребенка.

Дополнительно ученые проверили особый тип модификации — метилирование цитозинов вне CpG-контекста (так называемое mCA-метилирование). В организме человека оно появляется только в постнатальный период и служит маркером окончательного созревания нейронов коры. В органоидах накопление mCA-меток происходило строго во времени и преимущественно в областях суперэнхансеров переднего мозга — регуляторных участков ДНК, управляющих генами взрослого мозга.

Чтобы убедиться, что накопление меток не связано с простым количеством делений клеток, авторы проанализировали участки ДНК типа solo-WCGW, которые теряют метилирование при каждом цикле удвоения клетки. Эти маркеры оставались стабильными. Это доказало, что эпигенетические часы отражают именно процесс возрастного созревания ткани, а не механическое накопление клеточных делений.

Эксперимент с химерами: память клеток о пройденных стадиях

Одним из ключевых результатов работы стало изучение клеточной памяти. В биологии развития известно, что клетки-предшественники (прогениторы) со временем теряют универсальность: сначала они производят нейроны глубоких слоев коры, затем переключаются на нейроны верхних слоев (в частности, проекционные нейроны мозолистого тела — CPN), а в конце прекращают образование нейронов и создают только глию.

Исследователи проверили: помнит ли клетка-предшественник свой возраст, или ее развитие можно перезапустить, если поместить ее рядом с молодыми эмбриональными клетками?

Для этого авторы создали гетерохронные «химероиды» — составные органоиды, в которых объединили клетки разного возраста:

• старые прогениторы из органоидов возрастом 9-12 месяцев;
• молодые прогениторы из органоидов возрастом 15 дней.

Чтобы различать потомство этих клеток, ученые использовали клеточные линии от разных доноров с индивидуальными генетическими маркерами.

Молодые клетки начали выделять во внешнюю среду регуляторные молекулы, характерные для раннего эмбриогенеза. Под действием этих сигналов старые прогениторы вышли из состояния покоя и снова начали делиться, производя новые нейроны.

Однако старые клетки не начали цикл развития с самого начала. Они не стали производить клетки глубоких слоев или ранние типы нейронов, которые уже производили несколько месяцев назад. Вместо этого они сразу перешли к генерации поздних нейронов верхних слоев (SATB2+ CPN). Всего за 14 дней после объединения старые клетки произвели 49% нейронов позднего типа — процесс, который у молодых клеток занимает от двух до трех месяцев.

В то же самое время молодые клетки внутри того же химероида вели себя в строгом соответствии со своим возрастом: они формировали только ранние эмбриональные структуры (радиальную глию, клетки Кахаля — Ретциуса и нейроны глубоких слоев).

Этот эксперимент доказал два факта:

1. Клетки-предшественники коры мозга обладают необратимой временной памятью, зафиксированной в структуре их хроматина.
2. Внешние химические сигналы могут повторно запустить процесс деления клетки, но не могут стереть информацию о том, сколько времени она уже развивалась. Прогенитор продолжает выполнение программы строго с того шага, на котором он остановился.

Значение результатов для биомедицины и теории эволюции

Возможность поддерживать кортикальные органоиды в живом и функциональном состоянии на протяжении пяти лет решает несколько фундаментальных и прикладных задач.

Во-первых, работа дает ответ на вопрос об эволюционных механизмах неотении. Медленный темп созревания человеческого мозга не является вторичным следствием роста тела, питания или сенсорных стимулов. Этот темп автономен и управляется молекулярными механизмами, закодированными в геноме самих нейральных клеток.

Во-вторых, медицина получает инструмент для моделирования заболеваний, которые проявляются у человека только после рождения. Большинство нарушений развития нервной системы — включая расстройства аутистического спектра, шизофрению, синдром Ретта и ранние формы эпилепсии — связаны с нарушением формирования синапсов и миелинизации в первые годы жизни. До сих пор изучать эти процессы на живых клетках человека было невозможно из-за гибели клеточных культур на ранних сроках.

Пятилетние органоиды создают основу для тестирования лекарственных препаратов на тканях, находящихся на требуемой стадии зрелости, и открывают возможность изучать биологические механизмы формирования человеческого мышления на молекулярном уровне.

Источник: Nature