Как человеческий глаз различает цвета? Ученые впервые расшифровали атомную структуру белков колбочек

Человеческий глаз воспринимает электромагнитные волны в диапазоне примерно от 400 до 700 нанометров. Этот спектр делится в нашем сознании на цвета: от фиолетового до красного. Процесс превращения физических волн в нервные импульсы называется зрительной фототрансдукцией. Он протекает в специализированных нервных клетках сетчатки — фоторецепторах, которые делятся на палочки и колбочки.

Палочки отвечают за зрение при слабом освещении. В них содержится один тип пигмента — родопсин. Колбочки работают при ярком свете и обеспечивают дневное цветное зрение. У человека есть три типа колбочек, каждый из которых содержит свой зрительный пигмент: синий, зеленый или красный.

Долгое время ученые детально представляли устройство только родопсина. Его молекулярную структуру определили еще в 2000 году с помощью метода рентгеноструктурного анализа. Сделать то же самое для белков колбочек не удавалось на протяжении двадцати четырех лет. Белки колбочек нестабильны, быстро разрушаются при извлечении из клеточной мембраны и присутствуют в тканях глаза в крайне низкой концентрации. Только благодаря развитию технологий молекулярной биологии и криоэлектронной микроскопии исследователям удалось выделить эти белки и определить их точное пространственное строение.

Метод исследования и подготовка образцов

Для определения структуры белков исследователи синтезировали человеческие опсины колбочек в клетках насекомых (культура клеток Sf9). Чтобы стабилизировать хрупкие мембранные молекулы, ученые применили комплексный метод. Во-первых, они ввели в структуру генов опсинов точечные мутации, которые фиксируют белок в активированном состоянии. Во-вторых, для предотвращения распада белков использовали систему белковых меток NanoBiT. Эти метки связывали концы рецептора и вспомогательных молекул, обеспечивая дополнительную механическую стабильность.

Для фиксации структуры также применили фрагменты антител (scFv16). Полученные комплексы, состоящие из опсина колбочки, ретиналя и внутриклеточного G-белка, очистили и заморозили в тонком слое жидкого этана при температуре около -180 градусов Цельсия. Этот метод позволяет мгновенно превратить воду в аморфный лед, не повреждая структуру белков кристаллами.

Далее образцы исследовали с помощью криоэлектронного микроскопа. Исследователи получили пространственные карты плотности с высокой точностью: для красного пигмента разрешение составило 3,4 ангстрема (десятимиллиардная доля метра), для синего — 2,6 ангстрема, а для зеленого — 2,5 ангстрема. Это позволило построить точные атомные модели всех трех рецепторов.

Химический механизм улавливания света

Все зрительные пигменты относятся к группе рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCR). Молекула такого рецептора состоит из белка (опсина), который проходит сквозь мембрану клетки в виде семи спиралей. Внутри этой структуры находится полость, в которой закреплена светочувствительная молекула небелковой природы — 11-цис-ретиналь.

Процесс восприятия света начинается с того, что ретиналь поглощает фотон. Это приводит к химической реакции — изомеризации. Молекула меняет свою пространственную форму, переходя из согнутой (цис) формы в прямую (транс).

Изменение формы ретиналя вызывает механическое смещение трансмембранных спиралей опсина. Спирали раздвигаются, что приводит к изменению формы всего белка на внутриклеточной стороне. Там открывается участок, к которому присоединяется внутриклеточный сигнальный G-белок (трансдуцин).

Присоединение G-белка запускает химическую реакцию. Активируется фермент фосфодиэстераза, который начинает разрушать молекулы циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). В темноте высокая концентрация цГМФ удерживает ионные каналы в мембране клетки открытыми, позволяя ионам натрия и кальция проникать внутрь. При освещении каналы закрываются из-за падения уровня цГМФ. Поток положительно заряженных ионов прекращается, электрический заряд на мембране клетки меняется (происходит гиперполяризация), и этот электрический сигнал передается по нервным клеткам в мозг.

Спектральная настройка: почему мы видим разные цвета

Самый важный теоретический вопрос, который стоял перед исследователями: как разные типы колбочек поглощают свет разной длины волны, если во всех трех случаях светочувствительным элементом является одна и та же молекула ретиналя?

Физический анализ показал, что спектр поглощения ретиналя меняется под действием электрического поля, которое создают окружающие его аминокислоты белка. Различные типы опсинов имеют разный состав аминокислот в полости, где удерживается ретиналь. Это явление называется спектральной настройкой.

Сравнение красного и зеленого пигментов показало, что их белковые последовательности совпадают на 96%. В полости, где находится ретиналь, различие обнаружилось лишь в одном элементе — в позиции 285. В красном пигменте на этом месте находится аминокислота треонин, содержащая гидроксильную группу (атом кислорода и водорода). В зеленом пигменте эту позицию занимает аланин, у которого гидроксильной группы нет.

Присутствие полярной гидроксильной группы треонина меняет электрическое поле вокруг ретиналя. Это снижает энергию, необходимую для перехода молекулы в возбужденное состояние. В результате красный пигмент реагирует на более длинные световые волны с меньшей энергией. У зеленого пигмента из-за отсутствия этой группы энергия возбуждения выше, поэтому он поглощает более короткие волны.

Синий пигмент устроен иначе. Он значительно сильнее отличается от красного и зеленого по аминокислотному составу. Исследователи обнаружили, что в полости синего пигмента находятся полярные аминокислоты серин в позициях 87, 289 и 292. Они расположены вблизи места крепления ретиналя к белку (так называемого шиффова основания). Эти серины стабилизируют молекулу в невозбужденном состоянии. Для того чтобы изменить форму стабильной молекулы, требуется фотон с высокой энергией. Этому требованию соответствуют короткие волны синего и фиолетового диапазонов спектра.

Молекулярные причины цветовой слепоты

Нарушения цветового зрения связаны с мутациями в генах, кодирующих белки колбочек. Полученные трехмерные модели позволили детально рассмотреть, как именно эти мутации нарушают работу рецепторов.

Одной из наиболее изученных причин цветовой слепоты является мутация C203R в красном и зеленом пигментах. В нормальном белке аминокислота цистеин в позиции 203 образует ковалентную связь между двумя атомами серы (дисульфидный мостик) с другим цистеином в позиции 126. Эта связь жестко фиксирует одну из внешних петель белка, обеспечивая стабильность всей структуры.

При мутации C203R цистеин заменяется на аргинин. Аргинин не способен образовывать такие связи. Без этой молекулярной фиксации белок теряет стабильность, не может правильно свернуться при синтезе в клетке и быстро разрушается. В результате у человека полностью отсутствуют функциональные красные или зеленые колбочки (развивается протанопия или дейтеранопия).

Другие типы мутаций приводят к менее тяжелым последствиям, изменяя только чувствительность рецепторов. Например, мутация S116Y (замена серина на тирозин в позиции 116) в красном пигменте изменяет электростатическое поле в полости рецептора. Это приводит к так называемому синему сдвигу спектра поглощения. Красный рецептор начинает поглощать свет, длина волны которого ближе к зеленому спектру. Из-за этого снижается способность глаза различать оттенки красного и зеленого цветов.

Для синего пигмента ученые выявили шесть основных мутаций, приводящих к тританопии (неспособности воспринимать синий цвет), среди которых замены L56P (лейцина на пролин) и G79R (глицина на аргинин). Эти замены создают пространственные препятствия внутри молекулы белка, нарушая его стабильность и способность связывать ретиналь.

Практическое значение открытия и эволюционный аспект

Развитие методов генной терапии позволяет надеяться на создание способов лечения врожденной цветовой слепоты. Для этого необходимо доставить исправную копию гена в клетки сетчатки с помощью безвредных вирусных векторов. Однако для контроля эффективности такой терапии исследователям необходимо точно понимать, как именно синтезированный белок будет укладываться в мембране клетки и связываться с ретиналем. Точные пространственные модели, полученные в данном исследовании, предоставляют основу для такого проектирования.

Кроме того, новые данные важны для фундаментальной эволюционной биологии. Известно, что у большинства млекопитающих зрение является двухцветным (дихроматическим). Человек и некоторые другие приматы развили трехцветное (трихроматическое) зрение в процессе эволюции. Это произошло благодаря дупликации гена красного пигмента и его последующей мутации, которая привела к появлению зеленого пигмента.

Сравнение пространственных структур позволяет детально реконструировать этот эволюционный путь и понять, какие точечные изменения структуры белков позволили нашим предкам лучше находить спелые фрукты и молодые листья среди зеленой растительности.

Заключение

Результаты работы китайских ученых завершают многолетний этап исследований зрительной системы человека на молекулярном уровне. Теперь у науки есть полные физические модели всех белков, обеспечивающих дневное зрение.

Строгий анализ этих структур показывает, что наше цветовосприятие ограничено рамками физических параметров нескольких белков. Любое минимальное изменение расстояния между атомами в полости рецептора или замена одной аминокислоты меняют границы воспринимаемого нами мира. Изучение этих процессов на атомном уровне позволяет глубже понять, как биологические системы адаптируются к физическим законам окружающей среды, преобразуя электромагнитное излучение в информацию.

Источник: Science