Биологи выяснили, почему человек формируется дольше мыши: открыт белковый механизм времени

Эмбриональное развитие млекопитающих подчиняется единым генетическим законам. Человек, мышь, собака или кит используют практически одинаковый набор генов для построения тела: одни и те же сигнальные молекулы определяют, где сформируются голова, конечности и внутренние органы. Тем не менее временные рамки этого процесса у разных видов отличаются в разы.

Мышиному эмбриону требуется всего 15 дней, чтобы пройти путь от оплодотворения до завершения закладки всех ключевых органов. Человеческий эмбрион тратит на ту же самую работу около 60 дней. При этом порядок событий и пропорции развивающегося организма строго соблюдаются. В биологии развития эту видовую разницу в скорости называют аллохронией.

Долгое время оставалось неизвестным, где именно находится регулятор, определяющий темп развития конкретного вида. Международная группа исследователей из Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) и Института молекулярной клеточной биологии и генетики Общества Макса Планка в Дрездене нашла ответ на этот вопрос. Результаты их работы, опубликованные в научном журнале Developmental Cell, показывают: скорость развития зависит от того, насколько быстро внутри клеток разрушаются молекулы белков. У человека этот распад происходит значительно медленнее, чем у мыши, а контролирует эту скорость клеточный метаболизм.

Сегментационные часы: как эмбрион отсчитывает этапы роста

Чтобы изучать время в развивающемся организме, биологи используют классическую модель — процесс сомитогенеза. Так называют регулярное появление блоков ткани (сомитов) вдоль оси тела эмбриона. Впоследствии из этих блоков образуются позвонки, ребра, скелетные мышцы и глубокие слои кожи.

Закладка каждого нового сомита управляется так называемыми сегментационными часами. Это циклическая смена активности определенных генов в клетках пресомитной мезодермы. Концентрация соответствующих белков в клетках периодически повышается и падает через строго фиксированные интервалы времени:

• у эмбриона рыбы данио-рерио один цикл занимает 30 минут;
• у мыши — 2,5 часа (около 147 минут);
• у белого носорога — 4 часа;
• у человека — около 5 часов (примерно 322 минуты).

Сегодня этот процесс можно воспроизводить и детально исследовать вне живого организма. Ученые берут стволовые клетки человека или мыши и с помощью химических сигналов направляют их развитие в сторону пресомитной мезодермы. Полученные клетки называют индуцированной пресомитной мезодермой (iPSM). Оказалось, что такие клеточные культуры в лабораторной посуде сохраняют свойственную своему виду скорость пульсации без каких-либо внешних подсказок от материнского организма.

Главный элемент этих клеточных часов — регуляторный белок HES7. Он работает по схеме отрицательной обратной связи: когда ген HES7 активен, накапливающийся белок HES7 блокирует работу собственного гена. Со временем белок разрушается, блокировка снимается, и цикл начинается заново.

Предыдущие эксперименты показали, что молекула HES7 у человека разрушается в два раза медленнее, чем у мыши. Из-за этого человеческой клетке требуется больше времени на завершение одного цикла. Однако оставался фундаментальный вопрос: является ли медленный распад HES7 частным исключением для одного конкретного гена или вся человеческая клетка в целом живет в замедленном темпе?

Массовый анализ белков: метод изотопного мечения

Чтобы выяснить, как быстро разрушаются остальные белки, авторы исследования провели масштабный количественный анализ тысяч молекул одновременно. Для этого они применили метод динамического мечения стабильными изотопами аминокислот в клеточной культуре (SILAC) в сочетании с тандемной масс-спектрометрией.

Эксперимент состоял из нескольких последовательных этапов:

1. Устранение естественных колебаний. Поскольку концентрация многих белков во время работы сегментационных часов непрерывно меняется, эти циклы могли исказить измерения. Исследователи использовали систему редактирования генома CRISPR/Cas9 и полностью отключили ген HES7 в клетках человека и мыши. Клетки перестали ритмично пульсировать, но сохранили способность правильно развиваться.
2. Введение тяжелых изотопов. Клетки поместили в питательную среду, содержащую аминокислоты лизин и аргинин с тяжелыми стабильными изотопами углерода-13 (13C) и азота-15 (15N). Старые белки клеток состояли из обычных («легких») атомов, а все вновь создаваемые молекулы сразу включали в себя «тяжелые» изотопы.
3. Забор образцов по временной шкале. Клетки собирали через разные промежутки времени — от 30 минут до 12 часов после добавления изотопов.
4. Масс-спектрометрический анализ. С помощью масс-спектрометра ученые измеряли соотношение тяжелых и легких вариантов для каждого белка. По скорости исчезновения старых легких молекул рассчитывали период полужизни — время, за которое разрушается ровно половина исходного количества белка.
5. Математическая поправка на деление клеток. По мере роста клетки делятся, из-за чего концентрация старых белков падает просто путем разбавления. Исследователи определили скорость деления и вычли этот фактор из расчетов, чтобы получить истинную скорость разрушения молекул.

Авторы сопоставили данные по 3630 гомологичным (выполняющим одинаковые функции) белкам, которые присутствовали и в мышиных, и в человеческих клетках.

Результат показал масштабную системную разницу:

• Медианный период полужизни белков у мыши составил 24 часа.
• Медианный период полужизни белков у человека составил 37 часов.

В среднем белки в человеческих клетках разрушаются в полтора раза медленнее, чем в мышиных. Из 3630 исследованных белков 1753 разрушались у человека статистически значимо медленнее, и лишь у 126 белков распад шел быстрее, чем у мыши. У остальных белков разница была незначительной. Таким образом, замедленный распад оказался общим свойством почти всего белкового состава клетки.

Какие клеточные структуры очищаются медленнее

В живой клетке белки утилизируются двумя основными путями:

1. Убиквитин-протеасомная система. Специальные ферменты метят ненужный белок молекулой убиквитина. Затем меченый белок поступает в протеасому — крупный белковый комплекс, который расщепляет его на отдельные короткие фрагменты (пептиды). Этот путь отвечает в основном за растворимые белки в ядре и цитоплазме клетки.
2. Аутофагосомо-лизосомальная система. Крупные белковые скопления, мембранные белки и целые поврежденные органеллы захватываются мембранными пузырьками и доставляются в лизосомы, где расщепляются ферментами в кислой среде.

Авторы работы проверили, какой именно из путей деградации работает медленнее в клетках человека. Для этого они создали набор светящихся искусственных репортерных белков, каждый из которых направлялся в определенную часть клетки: в клеточное ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи или лизосомы. Затем с помощью химических блокаторов (вещества MG-132 против протеасом и бафиломицина A1 против лизосом) ученые выборочно останавливали работу этих систем.

Оказалось, что в человеческих клетках замедлены оба пути утилизации. И ядерные белки, расщепляемые протеасомами, и органеллярные белки, расщепляемые в лизосомах, сохраняются дольше, чем в клетках мыши.

Наиболее сильная разница между видами обнаружилась в белках клеточных мембран, митохондрий и эндоплазматического ретикулума: у человека они распадались в несколько раз медленнее, чем у мыши. Белки ядрышка показали меньшую разницу, но все равно оставались более стабильными в человеческих клетках. Это подтверждает, что снижение скорости распада затрагивает все внутренние компоненты клетки.

Метаболизм как регулятор скорости распада

Почему системы очистки в человеческих клетках работают с меньшей производительностью? Исследователи обратили внимание на энергетический обмен. Ранее было известно, что клетки ранних зародышей человека потребляют меньше глюкозы в пересчете на массу, чем клетки мыши.

Чтобы проверить прямую связь между расходом глюкозы и стабильностью белков, ученые применили химическое соединение 2-дезокси-D-глюкозу (2DG). Это вещество по своей структуре похоже на обычную глюкозу: клетка захватывает его, но не может расщепить, в результате чего процесс гликолиза (бескислородного распада сахаров) тормозится.

Мышиные клетки пресомитной мезодермы обработали 2DG, после чего повторно измерили параметры их жизнедеятельности:

• Стабильность белков выросла. Медианный период полужизни белков в мышиных клетках увеличился с 24 до 36 часов. Белковый состав мыши по своей стабильности практически сравнялся с человеческим (37 часов).
• Сегментационные часы замедлились. Период пульсации гена HES7 у мыши увеличился со 147 минут до 191 минуты.
• Дифференцировка затормозилась. Момент включения генов, запускающих созревание мезодермы (HES7, TBXT, MSGN1, TBX6), заметно сдвинулся по времени. Клетки стали медленнее переходить из состояния стволовых предшественников в зрелые ткани.

При этом угнетение гликолиза в первую очередь повлияло на протеасомную систему расщепления белков в ядре и цитоплазме, в меньшей степени затронув лизосомальную утилизацию мембранных белков. Тем не менее общего снижения скорости метаболизма оказалось достаточно, чтобы мышиные клетки переняли временные характеристики человеческих.

Экспериментальное подтверждение причинно-следственной связи

Чтобы исключить вероятность того, что замедление развития было вызвано побочной токсичностью химических препаратов, исследователи провели точечный генетический эксперимент.

Они создали мутантную форму мышиного белка Hes7. В аминокислотной последовательности молекулы заменили одну-единственную аминокислоту в позиции 211 — лизин заменили на аргинин (мутация получила название K211R). К этой позиции в норме присоединяется сигнальная метка убиквитина. Лишившись сайта связывания, мутантный белок потерял способность быстро разрушаться в протеасомах: период его жизни увеличился.

Когда этот искусственно стабилизированный белок ввели в мышиные клетки, период сегментационных часов сразу увеличился. При этом способность белка связываться с ДНК и подавлять работу целевых генов не нарушилась: изменилось исключительно время его распада.

Дополнительно ученые использовали клинический препарат бортезомиб, который избирательно подавляет активность протеасом. При добавлении малых доз этого вещества к человеческим клеткам период сегментационных часов удлинялся строго пропорционально дозе препарата: с исходных 320 минут до более чем 360 минут.

Эти данные доказали прямую причинно-следственную цепочку: скорость распада белков непосредственно задает период работы биологических часов и определяет скорость клеточного созревания.

Границы применимости и нерешенные вопросы

Авторы работы подчеркивают несколько ограничений, которые предстоит устранить в будущих исследованиях:

1. Многофакторность действия ингибиторов. Препарат 2DG не только тормозит гликолиз, но и может вызывать стресс эндоплазматического ретикулума и нарушать процесс гликозилирования (присоединения углеводных остатков к белкам). Хотя опыты проводились в короткие временные интервалы до появления признаков повреждения клеток, ученым еще предстоит выяснить точный вклад каждого из сопутствующих процессов.
2. Дополнительные звенья цепи. Стабильность белка зависит не только от работы самих протеасом или лизосом, но и от предварительных этапов: скорости навешивания убиквитиновых меток, работы ферментов деубиквитинирования и транспортировки молекул внутри клетки. Пока неизвестно, на каких именно из этих этапов возникают первичные различия между человеком и мышью.
3. Другие компоненты времени. Период сегментационных часов определяется не только распадом белков. На него влияют также задержки при созревании матричной РНК (сплайсинг интронов) и скорость синтеза новых молекул. Эти процессы в большей степени зависят от работы митохондрий, а не от гликолиза.

Практическое значение открытия

Установление связи между метаболизмом, стабильностью протеома и темпом развития важно как для фундаментальной науки, так и для прикладной биомедицины.

В области фундаментальной биологии эти результаты дают единое объяснение феномену аллохронии. Внутреннее время клетки определяется не абстрактной программой, а реальной скоростью химических реакций: утилизации субстратов и обновления белкового состава. Недавно схожие результаты были получены при сравнении клеток-предшественников нейронов человека и мыши, а также при анализе клеток соединительной ткани у долгоживущих млекопитающих. Виды с большой продолжительностью жизни и медленным эмбриогенезом демонстрируют устойчиво высокую стабильность белков во многих тканях.

В области практической медицины и клеточных технологий открытие дает инструмент для управления развитием тканей in vitro. В настоящее время выращивание функциональных тканей и органоидов (миниатюрных аналогов органов) из стволовых клеток человека занимает месяцы. Например, созревание нейронов коры головного мозга в лаборатории требует до полугода, что точно соответствует срокам внутриутробного развития плода.

Возможность точечно регулировать стабильность регуляторных белков через метаболические пути позволит ученым ускорять или замедлять дифференцировку клеток в лабораторных условиях. Это может существенно сократить время получения клеточного материала для трансплантации, тестирования лекарственных препаратов и моделирования наследственных заболеваний.

Источник: Developmental Cell